جستجو . ورود به وبگاه    ۱۳۹۶/۹/۲۵  
 
 

کتابخانه ديجيتال
گزارشات حاصل از طرح هاي پژوهشي خاتمه يافته


مشخصات گزارش:

۸۹۰۰۰۵۸۸ شماره طرح:
طراحي واكسنهاي نوتركيب ليشمانيا تارنتولي غير پاتوژنيك بيان كننده آنتي ژن E7 ويروس پاپيلوماي انساني نوع 16 متصل شده به پروتئين شوك حرارتي Gp96 و ارزيابي توانايي تحريك سيستم ايمني آنها در مدل توموري موش C57BL/6 عنوان طرح:
اعظم بوالحسني مجري:
پزشکي شاخه:
۸۹/۶/۲۷ تاريخ تصويب طرح:
۹۱/۷/۲ تاريخ پايان طرح:
۹۱/۷/۳ تاريخ انتشار:
توجه: براي دريافت اصل گزارشات لطفا از طريق با صندوق تماس حاصل نماييد. دانلود فايل گزارش:

چکيده:

سرطان سرويكال (دهانه رحم) بعنوان دومين سرطان شايع زنان در سراسر دنيا شناخته شده است (1). گزارشهاي متعددي در مورد ارتباط قوي بين ويروسها و توسعه بدخيمي هاي انسان وجود دارد. گروهي از DNA ويروسهاي انكوژني در جمعيت انساني موجودند و به عنوان عوامل عفوني سرطان در سراسر دنيا شناخته شده اند. اين گروهها شامل ويروس Epstein-Barr، هرپس ويروس (HSV)، پاپيلوما ويروس(HPV) و پليوما ويروس انساني مي شوند (2). سرطانهاي پوست، مقعد و سرويكال با ويروس HPV ارتباط دارند. عفونتهاي HPV كاملا داخل اپي تليال هستند و بيش از 130 سويه آنها شناخته شده اند. بررسيها نشان داده اند كه حدود 40 نوع ويروس پاپيلوماي انساني ناحيه ژنيتال را آلوده مي كنند. سويه هاي با ريسك بالا شامل HPV16 و HPV18 مي شوند و ارتباط قوي با سرطان سرويكال و مقعد دارند (4-1). ژنوم ويروس به صورت DNA دو رشته اي است كه از حدود 8000 جفت باز تشكيل شده است و هشت پروتئين تنظيمي E (1-8) و دو پروتئين ساختاري L (1, 2) را كد مي كند. در بيشتر سرطانهاي سرويكال، HPV به داخل ژنوم ميزبان نفوذ مي كند كه بعلت فقدان بيان ژن ويروسي E2 است كه يك رپرسور رونويسي بيان ژن E6 و E7 است. اين امر منجر به بيان افزايش يافته انكوپروتئينهاي ويروسي E6 و E7 مي شود. اثر كلي، تنظيم نامناسب و غلط چرخه سلولي و مهار آپوپتوزيس است. انكوپروتئين E6 به پروتئين P53 متصل مي شود و باعث تجزيه آن از طريق مسير يوبي كوئيتين- پروتئوزوم مي شود. اتصال انكوپروتئين E7به pRb منجر به آزاد شدن فاكتور رونويسي E2F مي شود و لذا رونويسي ژنهاي پاسخ دهنده به E2F افزايش مي يابد كه براي ورود به فاز سنتز (S) الزامي است (1، 5، 6). با توجه به مطالعات انجام گرفته، درمانهاي معمول نظير تخريب موضعي ( اسيدها و كرايوتراپي)، كموتراپي و جراحي اثر خاصي در برابر عفونتهاي ناشي از HPV نداشته و امكان برگشت بيماري متعاقب آن وجود دارد، بنابراين، توليد واكسن مناسب از اولويتهاي بهداشتي در جهان محسوب مي شود. با توجه به شيوع بيماريهاي مختلف مربوط به HPV در سراسر دنيا از جمله ايران و فقدان روشهاي تشخيصي مناسب (screening) آن بخصوص در كشورهاي در حال توسعه، مطالعات گسترده در اين زمينه حائز اهميت مي باشد. در ميان انواع روشهاي واكسيناسيون، DNA واكسن ها به عنوان واكسن هاي بي خطر، كارآمد، پايدار، مؤثر در ايجاد پاسخهاي ايمني سلولي و همورال، با پروسه توليد و حمل و نقل و ذخيره سازي آسان، مقاوم در برابر گرما و مقرون به صرفه بودن مورد توجه قرار گرفته اند (7). يكي از موارد قابل توجه در مورد DNA واكسن ها، قدرت محدود شده آنهاست. چندين استراتژي براي افزايش قدرت DNA واكسن ها بكار برده شده است نظير اتصال آنتي ژنها به پروتئينهاي شوك حرارتي (HSP) (18-8)، انتقال فيزيكي براي توليد ميزان بيشتر آنتي ژن، فرمولاسيون با ذرات كوچك (microparticles) براي هدف قرار دادن سلولهاي ارائه كننده آنتي ژن (APC) و .... يكي از روشهاي انتقال فيزيكي ﻣﺆثر الكتروپوريشن (EP) مي باشد كه باعث افزايش توليد آنتي ژن توسط تسهيل عبور DNA پلاسميد مستقيما به داخل سلولها مي شود. اين روش مي تواند براي انتقال DNA در حيوانات بزرگ و از جمله انسان ﻣﺆثر باشد. در حمايت از اين فرضيه، روش EP توانسته است هر دو پاسخهاي آنتي بادي و T-cell را در پريماتهاي غيرانساني افزايش دهد (19و 20). ايمنوتراپي بر اساس DNA واكسن هاي بيان كننده انكوپروتئينهاي E6 و E7 ويروس پاپيلوماي انساني در حال انجام هستند. بررسيها نشان داده اند كه ساختار اپتيمم شده tFE67Co {شامل tissue plasminogen activator (tpa) signal sequence, Flt3L, fusion of E6 and E7 and codon optimization} انتقال يافته با الكتروپوريشن مي تواند پاسخهاي قوي CD8+ T cell ويژه E6 و E7 را القاء كند (21). تحقيقات نشان داده اند كه تزريق DNA واكسن pNGVL4a-CRT/E7(detox) از طريق الكتروپوريشن، قويترين پاسخهاي ايمني سلولي را در مقايسه با تزريق داخل ماهيچه اي و داخل پوستي از طريق تفنگ ژني ايجاد مي كند و منجر به مهار رشد تومور مي گردد (22). در مطالعات باليني، اخيرا يك نوع DNA واكسن به نام VGX-3100 (شامل پلاسميدهاي بيان كننده پروتئينهاي E6 و E7 دو نوع ساب تايپ HPV16 وHPV18 ) از طريق الكتروپوريشن براي بيماران با سابقه CIN2 و CIN3 كه توسط جراحي درمان شده اند، مورد استفاده قرار گرفته است (23).

بعلاوه، مطالعات نشان داده اند كه استفاده از ارگانيسم زنده بسيار ايمونوژن تر از واكسن هاي ساب يونيتي نظير واكسن هاي DNA و پروتئين مي باشد. اگرچه استفاده از وكتورهاي زنده نوتركيب در استراتژي هاي جديد تهيه واكسن مورد توجه زيادي قرار گرفته اند، اما كاربرد آنها در انسان به عنوان كانديد واكسن با مشكلات زيادي از جمله انتقال و عرضه نامطلوب آنتي ژن، بيماريزايي و سميت خصوصا براي افراد داراي نقص ايمني مواجه بوده است (24). بنابراين نياز به استفاده از Live Vector Vaccine هايي مي باشد كه قدرت افزايش عرضه آنتي ژن و پاسخ هاي ايمني كارآمد را " بدون خطر ايجاد بيماري در انسان" داشته باشند. در مطالعاتي كه اخيرا انجام شده است مناسب بودن انگل ليشمانيا تارنتولي به عنوان Live Vector Vaccine به اثبات رسيده است. از ميان گونه هاي مختلف ليشمانيا، " ليشمانيا تارنتولي (Leishmania tarentolae) " انگل درون سلولي مي باشد كه براي انسان غيرپاتوژن بوده و به طور كارآمدي سلول هاي عرضه كننده آنتي ژن (APC) و ارگان هاي لنفاوي را مورد هدف قرار داده و منجر به بلوغ سلول هاي دندريتيك مي گردد. بر خلاف گونه هاي ديگر ليشمانيا، ليشمانيا تارنتولي درون APC هدف، قدرت تكثير نداشته و پس از چند روز از بدن ميزبان موشي خود حذف مي شود. با اين وجود با عملكرد ادجوانتي خود باعث ايجاد پاسخ ايمني حفاظتي Th1 و توليد IFNγ مي گردد. بعلاوه هيچ پاتوژنيسيته اي از آن حتي در موش هاي SCID (Severe Combined Immunodeficiency) كه داراي نقص در هر دو نوع پاسخ ايمني همورال و سلولي هستند، هم ديده نشده است. بنابراين از ليشمانيا تارنتولي مي توان به عنوان يك Safe Live Vector در روند تهيه واكسن بهره برد (25). محققان نشان داده اند كه ليشمانيا تارنتولي نوتركيب بيان كننده پروتئين Gag ازHIV قادر به انتقال ايمونوژن هاي HIV-1 به APC و ارگانهاي لنفاوي بوده و پاسخ ايمني سلولي قوي از نوعCD8+ T-cell response را در موش ايجاد مي كند كه آن هم باعث القاي ايمني طولاني مدت به واسطه توليد Memory CD4+ T-cells مي شود (26). در مطالعه ديگري نشان داده شده است كه ليشمانيا تارنتولي نوتركيب شده با ژن A2 ليشمانيا اينفانتوم، موش BALB/c را در برخورد با ليشمانيا اينفانتوم به دليل توليد مقدار زياد IFNγ كاملا محافظت مي كند (27).

براي ايجاد گونه هاي ليشمانياي نوتركيب، انتقال ملكول DNA نوتركيب به درون سلول (Transfection) به دو صورت گذرا يا خارج كروموزومي (episomal) و پايدار يا الحاقي (integration) مي تواند صورت گيرد. با توجه به محدوديتهاي انتقال گذرا (اپي زومال)، انتقال پايدار با استفاده از الحاق مجموعه ژني (DNA cassette) به درون ژنوم بسيار مورد توجه قرار گرفته است (28). هدف ما نيز طي اين پروژه آنست كه پلاسميد بياني خطي شده pLEXSY (29) همراه با ژنهاي هدف را از طريق نوتركيبي همولوگ در لوكوس 18SrRNA كروموزومي سويه هاي مختلف انگل الحاق نمائيم (ترنسفكشن پايدار).

با توجه به اطلاعات بدست آمده از اينترنت و ساير منابع اطلاعاتي، تحقيقات متنوعي روي انواع ويروس پاپيلوماي انساني به منظور توليد واكسن ﻣﺆثر در ساير كشورها انجام شده است و به دنبال روشهاي بهينه سازي آن براي استفاده در افراد مبتلا هستند. در ايران نيز، تحقيقات با توجه به شيوع بيماريهاي مختلف ناشي از اين ويروسها در حال انجام است نظير كار تحقيقاتي سابق ما براي تعيين ماركرهاي زيستي در مدل انساني (30) و مقايسه دو استراتژي واكسيناسيون يعني DNA واكسن و Prime-boost در مدل موشي (31) و يا بررسي افزايش قدرت DNA واكسن با استفاده از سيستم انتقالي پليمر-پپتيد (32). همچنين تحقيقات اپيدميولوژي نيز در اين زمينه در مراكز مختلف در حال انجام است.

در اين پروژه، با توجه به پتانسيل ايمني زايي پروتئين شوك حرارتي Gp96 در برابر بيماريهاي عفوني و برخي سرطانها، طراحي ساختارهاي DNA فيوژن با استفاده از قطعات N ترمينال و C ترمينال Gp96 متصل شده به E7 HPV16 بعنوان عامل آنتي ژني صورت خواهد گرفت. بعلاوه، با كلون كردن ژنهاي فيوژن E7-NT(gp96)-GFP و E7-CT(gp96)-GFP داخل وكتور بيان يوكاريوتي pLEXSY-neo و ترنسفكت كردن انگل ليشمانيا تارنتولي با اين پلاسميدهاي نوتركيب به صورت پايدار (integrate)، قصد داريم كه به ارزيابي ايمونوژنيسيته آنها در مدل موشي بپردازيم. لازم به توجه است كه به منظور بررسي بيان پروتئينها در ليشمانيا تارنتولي از ژنهاي فيوز شده با ژن گزارشگر GFP استفاده شد. بنابراين، تاييد بيان پروتئينهاي E7-NT(gp96) و E7-CT(gp96) با ميكروسكپ فلورسنت ميسر مي شود. سپس تزريق پلاسميدهاي بيان كننده ژنهاي كايمري E7-NT(gp96) و E7-CT(gp96) و نيز انگلهاي ليشمانيا تارنتولي نوتركيب بيان كننده E7-NT(gp96) و E7-CT(gp96) بصورت DNA/live و live/live به منظور القاء پاسخهاي ايمني ﻣﺆثر حفاظتي ضد توموري در مقابل تومورهاي زير پوستي موشهاي C57BL/6 انجام مي شود. نهايتا، با استفاده از تكنيكهاي الايزا (ELISA)، اندازه گيري پاسخهاي همورال و سلولي (IFN-) در مقابل پروتئين نوتركيب E7 بعنوان عامل آنتي ژني صورت خواهد گرفت. در صورت ايمنوژن بودن انگلهاي نوتركيب و توليد پاسخ ايمني سلولي ﻣﺆثر، مي توان در مطالعات بعدي از آنها به عنوان يك Live Recombinat Vaccine بر عليه سرطان ناشي از HPV بهره برد.


 
  جستجو در کتابخانه ديجيتال
نام مجري (نويسندگان):
عنوان گزارش:
چکيده و متن:
راهنماي جستجو
 
  ابزارهاي مشاهده
راهنمايي
دريافت فونت ها
تغيير رنگ هاي سايت
نسخه قابل چاپ اين صفحه
 
© تمام حقوق براي صندوق محفوظ است | صفحه اول | چاپ صفحه
آخرين بهنگام سازي اين صفحه: ۱۳۹۳/۱۱/۱ - ۱۶:۵۱